FORTEBIO的生物邏輯

我們的使命驅(qū)使我們盡一切可能開(kāi)發(fā)出可以治愈疾病的重要生物制劑。通過(guò)提供客戶(hù)的產(chǎn)品，了解客戶(hù)研究背后的科學(xué)知識(shí)，提供的服務(wù)以及成為尋找研究挑戰(zhàn)解決方案的可信賴(lài)合作伙伴，我們可以使客戶(hù)擺脫工作流程的瓶頸。

FORTEBIO 抗人 IgG 捕獲 (AHC) 生物傳感器

抗人 IgG 捕獲 (AHC) 生物傳感器

-動(dòng)力學(xué)等級(jí)

用于蛋白結(jié)合產(chǎn)物無(wú)標(biāo)記檢測(cè)的 Octet 生物傳感器代碼：18-5060，18-5061

開(kāi)始試驗(yàn)前，請(qǐng)完整讀取整個(gè)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)。僅供研究使用，不用于診斷程序。

O 垂直

抗人 IgG 捕獲 (AHC) 生物傳感器能夠?qū)⑷?IgG 或其他含有人 Fc 區(qū)的蛋白固定在生物傳感器表面。固定化蛋白可用于后續(xù)的動(dòng)力學(xué)相互作用分析。事件  AHC 生物傳感器的表面設(shè)計(jì)為提供穩(wěn)定的相互作用，使其適用于苛刻的動(dòng)力學(xué)應(yīng)用。

  INTE 編號(hào)US E

ForteBio 抗人 IgG 捕獲 (AHC) 生物傳感器，結(jié)合 Octet QK 系統(tǒng)或 Octet RED 系統(tǒng)，設(shè)計(jì)用于大分子相互作用的動(dòng)力學(xué)分析。AHC 生物傳感器可用于許多樣品類(lèi)型，包括純化蛋白、細(xì)胞培養(yǎng)上清液和細(xì)胞裂解物。

  P RI NCI PL E

使用抗人 IgG Fc 部分的高親和力抗體預(yù)固定抗人 IgG 捕獲 (AHC) 生物傳感器。該抗體可捕獲并固定人 IgG (hIgG) 或其他含 Fc 配體，以產(chǎn)生適用于相互作用分析的穩(wěn)定表面。捕獲表面特別適用于固定細(xì)胞培養(yǎng)上清液或其他復(fù)雜混合物中的 hIgG，其中生物素化不是一個(gè)選擇。

AHC 生物傳感器經(jīng)設(shè)計(jì)可耐受典型再生條件。在典型工作流程中，這允許捕獲目標(biāo) hIgG，分析人 IgG 與其分析物的結(jié)合，然后表面再生至其原始狀態(tài)。然后可以通過(guò)加載新的人 IgG 重復(fù)使用生物傳感器。

K I T C 打開(kāi)

Octet QK 和 Octet RED 系統(tǒng)的抗人 IgG 捕獲生物傳感器包含：

將生物傳感器儲(chǔ)存在室溫下的干燥處，避免陽(yáng)光直射。將生物傳感器作為銳器處置。收到后，生物傳感器可穩(wěn)定儲(chǔ)存 6 個(gè)月。

10x 動(dòng)力學(xué)緩沖液-10 mM 磷酸鹽、150 mM NaCl、0.02% 吐溫 20、0.05% 疊氮化納、1 mg/mL BSA (pH 7.4)。在 2-8 ℃ 下儲(chǔ)存直至失效。

  A DDITIO 編號(hào)M后結(jié)果R 等效 E D

需要以下附加材料：

• 人 IgG-可固定人 IgG 或其他含人 Fc 的蛋白。人 IgG 可以是純的，也可以是復(fù)雜混合物（如培養(yǎng)物上清液）的一部分。
• 調(diào)節(jié)/再生溶液-10 mM 甘氨酸 pH 值

表面處理和再生需要 1.7。根據(jù)固定分子，可能需要進(jìn)一步優(yōu)化 pH 值。

• 相互作用蛋白
• 試驗(yàn)緩沖液-推薦 1X Kinetics 緩沖液（用 PBS (pH 7.4) 以 1:10 稀釋 10X Kinetics 緩沖液）?？墒褂闷渌彌_液。在整個(gè)生物傳感器水合和所有測(cè)定步驟中，緩沖液保持一致時(shí)觀察到的結(jié)果。
• Octet QK 系統(tǒng)或 Octet RED 系統(tǒng)
• 96 孔微孔板-2 X 96 孔、黑色平底聚丙烯微孔板 (Greiner Bio-one#655209)

T EC HN IQUE SFO RO PTIMA LP ER FO RM AN CE

1. 在加載步驟之前，需要對(duì)生物傳感器進(jìn)行調(diào)節(jié)，以改善基線(xiàn)和表面穩(wěn)定性。通常調(diào)節(jié)包括 3 X 20 秒暴露于再生緩沖液和 1X 動(dòng)力學(xué)緩沖液交替。
2. 對(duì)于嚴(yán)格的應(yīng)用，建議使用由結(jié)合和再生循環(huán)組成的生物傳感器表面的“主要”。該預(yù)充結(jié)合循環(huán)應(yīng)包括從溶液中捕獲 hIgG，然后使用再生方案再生回原始表面。應(yīng)在表面處理后進(jìn)行預(yù)充。
3. 通常，生物傳感器表面的再生可以通過(guò) 5 X 5 秒暴露于 10 mM 甘氨酸 pH 1.7 與 1X 動(dòng)力學(xué)緩沖液交替實(shí)現(xiàn)。在某些情況下，可能需要根據(jù) hIgG 進(jìn)一步優(yōu)化再生。
4. 為了獲得良好性能，應(yīng)包括一個(gè)參考生物傳感器。參比生物傳感器應(yīng)加載 hIgG，并應(yīng)使用用于結(jié)合和解離步驟的緩沖液空白運(yùn)行。
5. 制備前，將試劑和樣本平衡至室溫。對(duì)于冷凍樣本，使用前解凍并充分混合。
6. 在 Octet 系統(tǒng)上進(jìn)行測(cè)定前，需要對(duì)生物傳感器進(jìn)行水合。生物傳感器在與整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中使用的緩沖液一致的緩沖液中水合將得到穩(wěn)定的結(jié)果。
7. 檢測(cè)樣本和生物傳感器水合溶液所需的小體積均為 200 μL/孔。
8. 確保 Octet 儀器打開(kāi)，并在開(kāi)始測(cè)定前將燈預(yù)熱至室溫至少 40 min。
9. 選擇文件 <unk>，在 Octet 軟件中設(shè)置樣品板溫度 實(shí)驗(yàn) <unk>  設(shè)置板溫度。輸入  所需溫度。ForteBio 建議測(cè)定  在 30 °C 下測(cè)定。在其他溫度下測(cè)定可能需要與本方案中討論的不同的測(cè)定時(shí)間。

  P RO 至 CO LO 垂直

1. 制備緩沖液、再生溶液、配體和相互作用的蛋白樣品。
2. 移取 200 μL 適當(dāng)?shù)乃先芤海糜?96 孔板中。將水合板插入，然后將生物傳感器置于生物傳感器托盤(pán)上，以水合生物傳感器。
3. 將 200 μL 各適當(dāng)樣品或緩沖液轉(zhuǎn)移至 96 孔板的適當(dāng)孔中。
4. 在 Octet 儀器上平衡水合生物傳感器組件和樣品板 10 min。
5. 開(kāi)始試驗(yàn)。
6. 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析并保存結(jié)果。

  S AMPL EP RE PA RA TI ON

制備前將試劑和樣本平衡至室溫，并充分混合。

1. 人 IgG 或其他含 Fc 配體– 配體是固定在生物傳感器表面的蛋白質(zhì)。含 Fc 配體的典型固定濃度為 5-25µg/mL。每個(gè)孔需要 200µL 配體。試驗(yàn)后可從微孔中回收配體溶液，并根據(jù)需要重復(fù)使用。

如果從細(xì)胞培養(yǎng)上清液中捕獲配體，如果用 1X Kinetics 緩沖液將上清液以至少 1:2 稀釋?zhuān)瑒t可獲得宜結(jié)果。如果該稀釋導(dǎo)致配體的總濃度較低，則生物傳感器可與細(xì)胞培養(yǎng)物在 4 C 下孵育過(guò)夜，以使含配體的 Fc 的上樣量大化。關(guān)于過(guò)夜裝載的提示，請(qǐng)參見(jiàn)  技術(shù)說(shuō)明TN3010_ 鏈霉親和素批次固定.

1. 相互作用蛋白-在嚴(yán)格的動(dòng)力學(xué)分析期間，建議運(yùn)行至少 4 種不同濃度的

   以稀釋系列形式相互作用的蛋白質(zhì)。高濃度應(yīng)比預(yù)期 KD 高約 10 倍。例如，對(duì)于預(yù)期具有低 nM 親和力的相互作用，相互作用蛋白的濃度 90 nM、30 nM、10 nM 和 3 nM 通?？商峁┝己玫膭?dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)。每份樣品需要 200µL 蛋白溶液的微孔體積。

   對(duì)于篩選試驗(yàn)或定性相互作用分析，相互作用蛋白的單一濃度足以表征結(jié)合。

2. 調(diào)節(jié)/再生溶液-抗人 IgG 捕獲生物傳感器可通過(guò)使用 10 mM 甘氨酸 (pH 1.7) 再生至捕獲表面水平。再生后，生物傳感器可重新加載 hIgG，用于新的相互作用分析。在重復(fù)再生中觀察到結(jié)合力的小幅損失。為了穩(wěn)定表面，建議執(zhí)行初始調(diào)節(jié)步驟。該調(diào)節(jié)包括在*相互作用試驗(yàn)前將生物傳感器暴露于再生緩沖液。

3. 對(duì)于分析的特定 hIgG/相互作用蛋白，可能需要進(jìn)一步優(yōu)化調(diào)節(jié)/再生溶液的 pH 值。

   O 尼龍 EIMMOBILIZATIO NP RO 至 CO L

   以下是在線(xiàn)固定中使用的典型檢測(cè)步驟列表。這些步驟由 Octet 系統(tǒng)*自動(dòng)化。

4. 基線(xiàn)（通常為 1X 動(dòng)力學(xué)緩沖液或培養(yǎng)基樣品）
5. 處理（推薦）。將生物傳感器暴露于再生溶液，以?xún)?yōu)化基線(xiàn)性能并穩(wěn)定面密度。
6. 預(yù)充綁定循環(huán)（可選）
7. 配體上樣（通常為 1X 動(dòng)力學(xué)緩沖液或培養(yǎng)基樣品）
8. 基線(xiàn)（通常為 1X 動(dòng)力學(xué)緩沖液）
9. 相互作用蛋白的關(guān)聯(lián)（通常為 1X 動(dòng)力學(xué)緩沖液）
10. 解離（通常為 1X 動(dòng)力學(xué)緩沖液）
11. 再生（10 mM 甘氨酸，pH 1.7）

12.  

13. 試驗(yàn)準(zhǔn)備 - 按照上述樣品制備章節(jié)所述，制備緩沖液、再生溶液、配體和相互作用蛋白。

14.  

15. 測(cè)定板 - 根據(jù)表 1 中的微孔板分布圖，將 200 μL 各檢測(cè)試劑轉(zhuǎn)移至 96 孔黑色平底聚丙烯微孔板中。

16.  

    	1	2	3	4	5	6	7
    A	緩沖液	10 mM 甘氨酸 pH 1.7	緩沖液	hIgG 或 Fc-配體	緩沖液	相互作用蛋白	緩沖液
    B	緩沖液	10 mM 甘氨酸 pH 1.7	緩沖液	hIgG 或 Fc-配體	緩沖液	相互作用蛋白	緩沖液
    C	緩沖液	10 mM 甘氨酸 pH 1.7	緩沖液	hIgG 或 Fc-配體	緩沖液	相互作用蛋白	緩沖液
    	… …	…	…	…	…	…	…
    H	緩沖液	10 mM 甘氨酸 pH 1.7	緩沖液	hIgG 或 Fc-配體	緩沖液	緩沖液	緩沖液

    表 1.接骨板分布圖示例。

     

    生物傳感器水化板制備-小心地從生物傳感器托盤(pán)組件上取下黃色生物傳感器架的頂部，并放置在工作臺(tái)上。將黑色 96 孔板牢固地放置在藍(lán)色生物傳感器托盤(pán)支架中。將 200 μL 水合溶液轉(zhuǎn)移到微孔板中與正在使用的生物傳感器的數(shù)量和位置相匹配的每個(gè)孔中。高度

    建議在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中使用的相同緩沖液中水合生物傳感器。

     

    將生物傳感器架與水合板對(duì)齊，更換生物傳感器架，注意不要刮擦或接觸生物傳感器底部。至少水合生物傳感器至關(guān)重要10 min在 Octet QK 系統(tǒng)或 Octet RED 系統(tǒng)上。

17. 生物傳感器和樣品板的儀器放置-將帶有 A1 的樣品板朝向 Octet QK 儀器或 Octet RED 儀器中樣品板載物臺(tái)的右后角放置。

18. 將生物傳感器托盤(pán)放在 Octet 儀器左手側(cè)的生物傳感器平板臺(tái)上。

    確保生物傳感器托盤(pán)和樣品板均牢固就位。進(jìn)入“儀器準(zhǔn)備和編程”。

      I結(jié)構(gòu) TPRE pa RA TI Ona daP RO GR AM IN G

    確保 Octet 儀器及其計(jì)算機(jī)已打開(kāi)。必須將燈預(yù)熱至少 40 min。

    雙擊 Octet User Software 圖標(biāo)     并允許 Octet 完成初始化。從菜單中選擇實(shí)驗(yàn)

    è    新   動(dòng)力學(xué)  實(shí)驗(yàn)  (Ctrl + K) . 按照以下順序填寫(xiě)每個(gè)選項(xiàng)卡所需的信息：

     

        傳感器 <-> 樣本分配

19. 使用鼠標(biāo)突出顯示生物傳感器板中使用的傳感器（方塊）。傳感器信息可直接輸入表格。
20. 使用鼠標(biāo)突出顯示含有樣本或試劑的孔。可將樣本信息直接輸入表格。
21. 輸入相互作用蛋白的濃度值。
22. 點(diǎn)擊“+“或“添加”執(zhí)行測(cè)定所需的測(cè)定步驟數(shù)。
23. 定義每個(gè)測(cè)定步驟。
    1. 在“數(shù)據(jù)名稱(chēng)”下，雙擊更改步驟名稱(chēng)
    2. 分析時(shí)間
    3. 在“流速”項(xiàng)下，輸入軌道流量振蕩器的 rpm。所有動(dòng)力學(xué)步驟（基線(xiàn)、締合和解離步驟）均應(yīng)在 1000 rpm 流速下進(jìn)行。
    4. 在“類(lèi)型”下，從下拉菜單中選擇步驟類(lèi)型。
24. 通過(guò)按應(yīng)執(zhí)行的順序分配生物傳感器、樣本及其相關(guān)試驗(yàn)步驟，創(chuàng)建試驗(yàn)方案。
    1. 點(diǎn)擊包含您希望使用的生物傳感器的列，選擇生物傳感器列。
    2. 從以下選項(xiàng)中選擇個(gè)定義的測(cè)定步驟步驟數(shù)據(jù)設(shè)置單擊該表。

25. 雙擊選定步驟中要使用的樣品列。該步驟將顯示在“檢定系統(tǒng)設(shè)置列表”中

     

        檢測(cè)定義

    在表 2 中，“步驟數(shù)據(jù)設(shè)置”是帶有相關(guān)參數(shù)的可編程步驟的示例列表。下表列出了典型檢測(cè)的步驟順序。

    如果運(yùn)行啟動(dòng)結(jié)合循環(huán)，則在上樣含配體的人 IgG 或 Fc（步驟 9）后，通過(guò) 5 次再生循環(huán)再生生物傳感器。啟動(dòng)后，生物傳感器應(yīng)重新加載含配體的人 IgG 或 Fc，并從步驟 8 開(kāi)始運(yùn)行試驗(yàn)。

1. 在選擇下一列生物傳感器之前，完成剩余試驗(yàn)步驟。

表 2.檢測(cè)步驟和相關(guān)參數(shù)示例。再生后，重復(fù)步驟 8-22 以重新加載并進(jìn)行下一次試驗(yàn)。* 在 Octet QK 上，使用 Regen 步驟類(lèi)型。在 Octet RED 上，使用自定義步驟類(lèi)型。

    運(yùn)行實(shí)驗(yàn)

1. 選擇瀏覽按鈕，保存原始數(shù)據(jù)的位置。強(qiáng)烈建議將數(shù)據(jù)保存到本地驅(qū)動(dòng)器 (C:/)。運(yùn)行完成后，可將數(shù)據(jù)傳輸至網(wǎng)絡(luò)驅(qū)動(dòng)器。
2. 輸入實(shí)驗(yàn)運(yùn)行名稱(chēng)（子目錄），其為所有原始數(shù)據(jù)文件和與實(shí)驗(yàn)相關(guān)的實(shí)時(shí)綁定圖表創(chuàng)建一個(gè)新文件夾。  如果默認(rèn)名稱(chēng)不可接受，輸入板名稱(chēng)。
3. 勾選“延遲實(shí)驗(yàn)開(kāi)始框”。輸入 300 秒，使樣品達(dá)到測(cè)定溫度所需的平衡時(shí)間為 5 min。
4. 默認(rèn)設(shè)置將確保自動(dòng)保存運(yùn)行時(shí)圖表。
5. 點(diǎn)擊開(kāi)始試驗(yàn).